Osteokalcin_S

Abstrakt

Hlavní nekolagenní protein, produkovaný osteoblasty. Používá je jako marker osteoformace. Zodpovědný za vazbu mezi organickou a anorganickou složkou kosti.

Fyziologická variabilita

Diurnální rytmus s kolísáním kolem 10 – 20% kolem střední hodnoty, peak se dosahuje mezi 05:00 až 06:00 hodin, rytmus nekoreluje s rytmem 1,25-(OH)2-vitaminu D. Intraindividuální variabilita se udává mezi 5.4 až 11.2%, skupinová variabilita mezi 20.5 až 30.9%, kompozitní pak mezi 21.2 až 32.2% (Friedecký, 1996). Všechny údaje zahrnují analytickou variabilitu. Intraindividuální rozptyl (bez analytického rozptylu) je u mužů 10,5%, u žen 7,5%, interindividuální rozptyl 25,2% u mužů a 34,4% (Panteghini, 1995).

Sezónní variace se vzestupem v zimních měsících.

Patofyziologické mechanismy ovlivňující koncentraci

Věk, pohlaví, rasa, denní rytmus, geografická poloha, hormonální situace, renální funkce, stupeň karboxylace osteokalcinu, léky ovlivněná vazba osteokalcinu na kost.

Výraznější závislost na rase, pohlaví a věku (vyšší hodnoty u novorozenců a dětí než u dospělých). U novorozenců stoupají hodnoty během během prvního měsíce života a dosahují vrcholu mezi 6 až 12 měsícem, pak klesají a zůstávají přibližně konstantní do puberty, kde je další vrchol hladiny se současným zvýšením sérové ALP. U dospělých mužů osteokalcin poklesá po pubertě a zůstává dále konstantní. U dospělých žen je do menopauzy průběh podobný, ale po menopauze stoupá. Nižší hodnoty jsou u černochů. Diurnální variace (není ovlivněna menstruačním cyklem), pokles hodnot ráno, nejnižší odpoledne, pak vzestup během spánku s maximem kolem 4.00 hodiny ráno. V graviditě hodnoty různé, nízké hodnoty ve druhém trimestru a vysoké ve třetím trimestru, během laktace dále stoupá.

Omezení stanovení

Intaktní osteokalcin s úplnou aminokyselinovou sekvencí je samovolně štěpen účinkem sérových proteáz za vzniku nedefinované směsi intaktní molekuly a jejích zbytků. Fragmentace molekuly se projevuje změnou imunoreaktivity. Ta může klesat při pokojové teplotě o 50-70% během 6-24 hodin (Blumsohn, 1997), při +4 stupních Celsia o 40-72% během 7 dnů, pokles lze zaznamenat i při skladování při -20, resp. -70 stupních Celsia, není-li jako antikoagulans použit heparinát (Noonan, 1996). Jiní autoři ale před používáním heparinu varují, protože může koncentrace zvyšovat (Sokoll, 1995). Nestabilita závisí na na typu protilátky použité v diagnostické soupravě i vlastním uspořádání soupravy (jinak se mohou chovat soupravy RIA a ELISA).

Nejčastěji se vyskytující molekuly osteokalcinu a jeho fragmentů jsou dány zejména možností štěpení vazby mezi dvojicí arginin-arginin v pozici 19 a 20, resp. 43 a 44:

Intaktní osteokalcin 1-49

Kompletní molekula, ve formě plně karboxylované nebo ve formě subkarboxylované až dekarboxylované. Intaktní molekula u zdravých osob představuje asi 36% cirkulujícího osteokalcinu u normálních osob, 46% u osteoporózy a 26% u chronického selhání ledvin (Kent, 1997).

N-terminální mid-fragment 1-43

Považuje se za nejstabilnější, zahrnuje asi 30% imunoreaktivity cirkulujícího osteokalcinu.

Další fragmenty: fragment 1-19, fragment 44-49, fragment 20-43, fragment 20-49

Možnosti stanovení (neúplný přehled):

1. Human Osteokalcin Radioimmunoassay Kit, Nichols Institute, USA (IRMA, intaktní a N-Mid fragment).

2. ELSA Osteo Cis -Bio International, Francie (IRMA, intaktní 1-49 a N-Mid fragment 1-43, protilátky proti epitopu 5-13 a 25-37, kalibrátorem je lidský osteokalcin).

3. Enzymun-Test Boehringer Mannheim, Německo (měří intaktní a N-Mid fragment).

4. Dako, Dánsko, imunoenzymatická souprava

5. Novocalcin, Metra Biosystems, USA (ELISA, měří nově syntetizovaný intaktní osteokalcin s lidským osteokalcinem jako kalibrátorem)

6. OSTK-PR Cis-Bio International, Francie, RIA, bovinní osteokalcin jako kalibrátor.

7. ELSA-OST-NAT (IRMA, Cis-Bio International, Francie, stanovuje pouze intaktní osteokalcin, protilátka proti epitopu 5-13 a 43-49, lidský osteokalcin jako kalibrátor)

8. Osteokalcin RIA, Nichols Institute, USA (lidský osteokalcin jako kalibrátor).

9. OSCA Test osteocalcin RIA, Brahms-Henning, Německo (stanovuje z 97% intaktní osteokalcin, protilátky proti epitopu 39-49 nebo 37-49, lidský osteokalcin jako kalibrátor).

10. ACTIVE, DSL (IRMA, stanovuje asi z 81% intaktní osteokalcin, částečně fragment 1-43, kalibrátor lidský osteokalcin)

11. RGP Mitsubishi, Japonsko (IRMA, stanovuje asi z 80% intaktní osteokalcin, částečně fragment 1-43, protilátky proti epitopu 12-33 a 30-49, kalibrátorem je syntetický lidský osteokalcin).

12. N-tact Osteo SP, Incstar (IRMA, stanovuje z 98% pouze intaktní osteokalcin, protilátky proti epitopu 1-10 a 43-49, kalibrátorem je osteokalcin 1-49).

Platí, že porovnatelnost souprav je velmi obtížná (Diego, 1994, Souberbielle, 1997).

Vyšetření se provádí ze séra, EDTA (vzhledem k závislosti konformace a imunoreaktivity na koncentraci kalcia ve vzorku bylo popsáno zvýšení, snížení i neprokazatelný efekt na koncentrace) a heparinová (zvýšení koncentrace průměrně o 8%) plazma se nedoporučuje. Pro určité soupravy se naopak doporučuje heparinát lithný, případně s aprotininem (Noonan, 1996). Hemolýza vadí, protože hemolytické vzorky vykazují větší pohotovost k fragmentaci osteokalcinu. Některá antikoagulancia uvolňují peptidázy z erytrocytů a zvyšují tak fragmentaci.

Odběr se provádí do předem vychlazených zkumavek (vhodněji s aprotininem), umístěných až do doby centrifugace ve vodní lázni s tajícím ledem, do 60 minut od odběru centrifugace při +4 až +8 stupních Celsia, pak se vzorek séra okamžitě zamrazí na -20 °C.

Způsoby potlačení nestability:

1) odběr do ledové tříště (viz výše), okamžité odeslání do laboratoře, centrifugace bez časové prodlevy, okamžité zpracování nebo zmražení při nejméně -20 °C.

2) odběr do zkumavky s použitím vhodného antiproteolytického činidla, obvykle aprotinin v množství 500 kalikreinových inhibičních jednotek na 1 ml krve (Banfi, 1994, Noonan, 1996)

Kalibrace stanovení zatím není jednotná, používá se buď intaktního nebo syntetického osteokalcinu. Intaktní (lidský nebo hovězí)  získaný izolací a purifkací z kostní hmoty je karboxylovaný, syntetický je nekarboxylovaný, z čehož vyplývá možnost rozdílné imunoreaktivity. Další rozdíly jsou v použití protilátek proti různým epitopům v různých diagnostických soupravách. Důsledkem jsou odlišné referenční intervaly pro různé metody a diagnostické soupravy.

Použití pro klinické účely

Vzhledem k obtížné porovnatelnosti diagnostických souprav (Diego, 1994, Sauberbielle, 1997) je nejvhodnější vyjadřovat výsledky ve vztahu k referenčním hodnotám. Přesto je porovnání obtížné – ne-li nemožné – u osob s renálním selháním a pravděpodobně i jinými stavy.

Zvýšení hodnot osteokalcinu v plazmě (séru)

·         dětský věk, v pupečníkové krvi jsou koncentrace 2-3x vyšší, zvýšení hlavně v prvním měsíci života, rychle rostoucí děti mají vyšší koncentrace,

·         hojení fraktur,

·         kostní metastázy bez hyperkalcémie, jedná-li se o hyperkalcémii při tumorech, je osteokalcin naopak snížen,

·         Pagetova choroba, až 40% nemocných může mít normální koncentrace osteokalcinu, osteokalcin se zvyšuje méně, než jiné ukazatele osteoformace nebo kostního obratu, zvažuje se možnost sníženého uvolňování osteokalcinu do cirkulace,

·         primární hyperparathyreoidismus, koncentrace osteokalcinu koreluje s koncentrací PTH, kalcia a hmotností adenomu, po parathyreoidektomii se osteokalcin vrací k normě během 2 – 6  měsíců,

·         sekundární hyperparathyreoidismus, zvýšení je obvykle následkem poruchy renální eliminace, která je příčinou sekundárního hyperparathyreoidismu,

·         renální insuficience (porucha eliminace), vzestup teprve při poklesu glomerulární filtrace pod 0,66 ml/s na 1,73 m2 tělesného povrchu,

·         hyperthyreóza, zvýšení na dvojnásobek až trojnásobek normy, koncentrace mohou korelovat s koncentracemi thyreoidálních hormonů, po zahájení terapie hyperthyreózy se osteokalcin vrací k normě během 16 týdnů,

·         renální osteodystrofie, při kostní lézi s vysokým obratem,

·         osteomalacie, korelace s kostními depozity aluminia, není prokázán vztah k mineralizaci, pouze k produkci osteoidu,

·         u nemocných léčených 1,25-dihydroxyvitaminem D,

·         laktace,

·         antikonvulziva,

·         osteogenesis imperfekta,

·         po terapii fluoridy,

·         hypermagnezemie,

·         akromegalie,

·         terapeutické podávání růstového hormonu, terapie vede k normalizaci předtím snížených koncentrací osteokalcinu,

·         fyzická zátěž,

·         kofein,

·         akromegalie,

·         u starých postmenopauzálních žen při současně zvýšené osteorezorpci (Garnero, 1996),

·         falešné zvýšení při uvolnění osteokalcinu z trombocytů během srážení krve,

·         terapie vitaminem K (zejména terapie předchozího deficitu vitaminu K).

Snížení koncentrací v plazmě (séru)

·         deficit vitaminu K,

·         deficit růstového hormonu u dětí, pokles až o 60% proti stejně starým jedincům,

·         léčba bisfosfonáty, po zahájení léčby bisfosfonáty se nejdříve sníží markery osteorezorpce (NTx, CTx a celkový DPD za 2-4 týdny), později markery osteoformace (osteokalcin a kostní ALP za 8-12 týdnů) (Bettica, 1997),

·         podávání warfarinu (antagonista vitaminu K), warfarin má dva efekty: 1. snižuje uvolňování osteokalcinu z osteoblastů, 2. snižuje karboxylaci osteokalcinu. Při krátkodobém podávání warfarinu se ale nemusí změnit celkový osteokalcin, protože stoupá podíl nekarboxylovaného osteokalcinu, z tohoto důvodu se měření koncentrace nekarboxylované frakce považuje za citlivý marker deficitu vitaminu K nebo efektu léčby antikoagulancii typu warfarinu (Sokoll, 1995).

·         osteopenie po kortikoidech, je známkou snížené formace skeletu, pokles je závislý na dávce kortikoidu, může být zjištěn již po krátkodobé léčbě (Delmas udává 30% pokles po 9 dnech prednisonu v dávce 30 mg denně),

·         hypoparathyreóza,

·         maligní hyperkalcémie, osteokalcin koreluje negativně s kalcémií při osteolytických metastázách skeletu s hyperkalcémií,

·         myelom v pokročilých stádiích a/nebo s hyperkalcémií, nejnižší koncentrace u lytických kostních lézí s hyperkalcémií, osteokalcin odráží histologickou heterogenitu mnohočetného myelomu a při remisi po chemoterapii se vrací k normě,

·         revmatoidní arthritis, osteokalcin se snižuje bez ohledu na to, zda je nebo není pacient léčen kortikoidy,

·         orální kontraceptiva (Garnero, 1995).

Bez vlivu na koncentraci osteokalcinu v plazmě (séru)

·         osteoporóza, průměrné normální koncentrace u skupiny nemocných s neléčenou osteoporózou, ovšem s velkou heterogenitou hodnot,

·         rezorpce kosti bez současné novotvorby,

·         krátkodobé podávání warfarinu nepřesahující 7 dnů (Sokoll, 1995).

Osteokalcin u kostních onemocnění (O´Loughlin, P.D., 1989, platí pro starší typ kalibrace, je vhodné posuzovat vzájemné vztahy hodnot):